Categoria: Effetti collaterali

Introduzione:

Da quando esistono gli eventi sportivi, il desiderio di ottenere un vantaggio competitivo è sempre stato presente. Con gli enormi incentivi finanziari e le conseguenti pressioni per eccellere associate all’industria sportiva internazionale, i tentativi di ottenere un vantaggio competitivo, in particolare con l’uso di farmaci che migliorano le prestazioni, sono aumentati (Barroso et al., 2008). Nonostante le notizie sull’uso di sostanze per migliorare le prestazioni atletiche risalgano a secoli fa, i test sugli atleti per verificare l’uso di farmaci che migliorano le prestazioni sono iniziati, almeno nel blocco occidentale, solo nel 1968 (Barroso et al., 2008; Botrè, 2008). Da allora, il Comitato Olimpico Internazionale (CIO) e l’Agenzia Mondiale Antidoping (WADA) hanno costantemente aggiornato un elenco di sostanze vietate. I composti e i metodi inclusi nella lista sono quelli che possono essere utilizzati da un atleta per ottenere un vantaggio sleale (WADA, 2009b). Le sostanze presenti nella Lista proibita includono steroidi androgeni anabolizzanti, glucocorticosteroidi, ormoni peptidici e loro modulatori, antagonisti ormonali e loro modulatori, stimolanti, β2-agonisti, narcotici, alcol, β-bloccanti, cannabinoidi, diuretici e agenti mascheranti (WADA, 2009b). L’obiettivo di questo articolo è di rivedere la farmacologia dei diuretici e le applicazioni dei diuretici al doping sportivo, oltre a descrivere in dettaglio le metodologie analitiche attualmente descritte per rilevare e identificare i diuretici nelle urine. Tutte le classi di diuretici (descritte in dettaglio più avanti nel presente articolo) sono vietate nello sport competitivo.

I diuretici sono agenti terapeutici utilizzati per aumentare la velocità del flusso urinario e l’escrezione di sodio al fine di regolare il volume e la composizione dei liquidi corporei o di eliminare i liquidi in eccesso dai tessuti (Jackson, 2006). Sono utilizzati nella terapia clinica per il trattamento di varie malattie e sindromi, tra cui ipertensione, insufficienza cardiaca, cirrosi epatica, insufficienza renale, malattie renali e polmonari, oltre che per una più generale riduzione degli effetti negativi della ritenzione di sali e/o acqua (Jackson, 2006). I diuretici sono stati vietati per la prima volta nello sport (sia in gara che fuori) nel 1988 perché possono essere utilizzati dagli atleti per due motivi principali. In primo luogo, la loro potente capacità di rimuovere l’acqua dal corpo può causare una rapida perdita di peso che può essere necessaria per raggiungere una categoria di peso negli eventi sportivi. In secondo luogo, possono essere utilizzati per mascherare la somministrazione di altri agenti dopanti, riducendo la loro concentrazione nelle urine soprattutto grazie all’aumento del volume di queste ultime. L’effetto di diluizione delle urine dei diuretici permette di classificarli come agenti mascheranti e ne preclude l’uso sia in gara che fuori. Alcuni diuretici provocano un effetto mascherante anche alterando il pH urinario e inibendo l’escrezione passiva di farmaci acidi e basici nelle urine (Ventura e Segura, 1996; Goebel et al., 2004; Trota e Kazlauskas, 2004; Furlanello et al., 2007).

Nel 2008, i diuretici hanno rappresentato il 7,9% di tutti i risultati analitici avversi segnalati dai laboratori WADA, con un numero totale di 436 casi (WADA, 2009a). Tutte le classi di diuretici erano rappresentate nei casi positivi; l’idroclorotiazide è stato il diuretico più comunemente rilevato, con 137 casi. La Tabella 1 riassume le statistiche dei risultati positivi ai diuretici di tutti i laboratori WADA dal 2003 al 2009. In tutti e sei gli anni, tutte le classi di diuretici sono state rappresentate nei risultati positivi (WADA, 2004; 2005; 2006; 2007; 2008a; 2009a;). Nel corso degli anni, il numero totale di casi è aumentato; questa tendenza all’aumento dei risultati positivi può essere dovuta non solo a un aumento dell’abuso, ma anche al miglioramento dei metodi di rilevamento.

Sebbene l’applicazione principale dei diuretici sia quella di aumentare l’escrezione renale di sale e acqua, i loro effetti non si limitano al sodio e al cloruro; possono anche influenzare l’assorbimento e l’escrezione renale di altri cationi (K+, H+, Ca2+ e Mg2+), anioni (Cl-, HCO3- e H2PO4-) e acido urico (Jackson, 2006). Questa classe farmacologica di farmaci comprende composti con diverse proprietà farmacologiche e fisico-chimiche. Data la varietà dei composti diuretici, la classificazione di questi farmaci può basarsi su diversi criteri. Le categorie di classificazione più comuni sono: sito d’azione nel nefrone, efficacia relativa, struttura chimica, effetti sull’escrezione di potassio, somiglianza con altri diuretici e meccanismo d’azione (Jackson, 2006). Nella sezione seguente, questo articolo riassumerà brevemente la farmacologia e la tossicologia delle classi di diuretici in base al meccanismo d’azione. La Figura 1 mostra esempi di strutture diuretiche raggruppate per meccanismo d’azione: inibitori dell’anidrasi carbonica (CA), inibitori del simporter Na+/K+/2Cl- (diuretici dell’ansa), inibitori del simporter Na+/Cl- (diuretici tiazidici e simil-tiazidici), diuretici osmotici, inibitori dei canali Na+ dell’epitelio renale (alcuni diuretici risparmiatori di potassio) e antagonisti del recettore mineralcorticoide (MR); si noti la varietà delle strutture molecolari. La Figura 2 illustra in dettaglio il sito e il meccanismo delle classi di diuretici nel nefrone (Figura 2A).

L’identificazione e la quantificazione dei composti proibiti e/o dei loro prodotti metabolici è stato un compito importante nei test antidoping sportivi (Cowan e Kicman, 1997). Storicamente, la rilevazione dei diuretici nei campioni biologici è stata ottenuta utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) con rilevazione a raggi ultravioletti (UV-DAD). Tuttavia, la tecnica di rilevamento HPLC-DAD non è specifica per l’identificazione inequivocabile delle sostanze. Pertanto, per la conferma è necessaria la metodologia dello spettro di massa, secondo le normative antidoping internazionali (Trout e Kazlauskas, 2004; Thevis e Schanzer, 2007; WADA, 2009c). La gascromatografia/spettrometria di massa (GC/MS), dopo un’adeguata preparazione e derivatizzazione del campione, è stata, nell’ultimo decennio, la tecnica analitica più utilizzata per la rilevazione dei diuretici. Recentemente, tuttavia, a causa dell’eterogeneità delle strutture chimiche e delle proprietà fisico-chimiche dei diuretici e dell’avvento di una strumentazione più economica, si è diffuso l’uso della cromatografia liquida/MS (LC/MS) (Thevis e Schanzer, 2007). La preparazione del campione prima dell’analisi LC/MS è più semplice rispetto alla GC/MS e non è necessaria alcuna derivatizzazione. Ventura e Segura hanno pubblicato una revisione completa dell’analisi dei diuretici nel 1996 (Ventura e Segura, 1996). Questo articolo si concentrerà principalmente sugli sviluppi e sulle tecniche che sono state sviluppate da allora.

Farmacologia e tossicologia dei diuretici:

• Inibitori dell’Anidrasi Carbonica

Gli Inibitori dell’Anidrasi Carbonica (Figura 1A) sono per definizione una classe di sostanze che agiscono come inibitori della CA (carbonato deidratasi, carbonato idrolasi, E.C.4.2.1.1) nelle cellule del tubulo prossimale del nefrone (Figura 2B). La CA è un metalloenzima di zinco espresso nell’uomo come una famiglia di almeno 15 isoenzimi (Tashian, 2000), quattro dei quali (CA II, CA IV, CA XII e CA XIV) sono presenti nel rene (Schwartz, 2002). La CA di tipo II, l’isoenzima più potente, rappresenta il 95% della CA totale nel rene e si trova come proteina solubile nel citoplasma. La CA di tipo IV, un isoenzima legato alla membrana, si trova nelle membrane luminali e basolaterali. Questo enzima svolge un ruolo chiave nel riassorbimento del bicarbonato e nella secrezione acida nel nefrone, catalizzando reversibilmente la reazione di idratazione della CO2 con la produzione di ioni H+ e bicarbonato. Sia la CA II che la CA IV sono inibite dai sulfamidici, in particolare dai sulfamidici aromatici con il gruppo funzionale -SO2NH2 non sostituito. La ridotta capacità di scambiare Na+ con H+ in presenza di questi diuretici determina una debole azione diuretica. Inoltre, il bicarbonato viene trattenuto nel lume con conseguente aumento del pH urinario a circa 8 e successivo sviluppo di un’acidosi metabolica. Anche l’escrezione di fosfato viene aumentata con un meccanismo non del tutto chiarito. L’escrezione di Ca2+ e Mg2+ non viene influenzata.

Attualmente sono disponibili tre principali inibitori della CA come diuretici (si veda la Figura 1A per le strutture): l’Acetazolamide (il prototipo della classe, una Sulfonamide senza attività antibatterica), la Diclorfenamide e la Metazolamide. Tutti mostrano una biodisponibilità orale del 100% con un’emivita di 6-14 ore. L’Acetazolamide e la Diclorfenamide sono escrete dai reni come farmaci intatti, mentre la Metazolamide è ampiamente metabolizzata. La principale indicazione terapeutica degli inibitori della CA è il glaucoma ad angolo aperto. L’Acetazolamide è spesso utilizzata per la prevenzione del mal di montagna da alta quota (AMS), un effetto patologico dell’alta quota sull’organismo causato dall’esposizione acuta a una bassa pressione parziale di ossigeno in alta quota che può progredire fino all’edema da alta quota (polmonare e cerebrale). (Coote, 1991; Botrè e Botrè, 1993). L’Acetazolamide aumenta l’escrezione di bicarbonato nelle urine, rendendo il sangue più acido e aumentando la ventilazione, favorendo così l’acclimatazione all’alta quota. L’Acetazolamide è utilizzata anche per il trattamento dell’edema. Gli inibitori della CA possono anche essere utilizzati terapeuticamente per il trattamento della ritenzione di liquidi pre-mestruale.

L’anidrasi carbonica è presente in numerosi tessuti extrarenali, tra cui l’occhio, la mucosa gastrica, il pancreas, il sistema nervoso centrale e gli eritrociti. A causa della diversa localizzazione nell’organismo, gli inibitori della CA sono tipicamente utilizzati per indicazioni non diuretiche, come il glaucoma, per diminuire la velocità di formazione dell’umor acqueo e di conseguenza ridurre la pressione intraoculare. È stato dimostrato che la somministrazione topica di dorzolamide, un inibitore della CA che abolisce l’attività enzimatica nel corpo ciliare, non produce alcun effetto diuretico (Mazzarino et al., 2001). Gli inibitori della CA sono utilizzati anche come farmaci antiepilettici, in parte a causa della produzione di acidosi metabolica.

La maggior parte degli effetti avversi, delle controindicazioni e delle interazioni farmacologiche sono conseguenza dell’alcalinizzazione urinaria o dell’acidosi metabolica. Gli effetti avversi, poco frequenti, sono simili a quelli dei sulfamidici. La deviazione dell’ammoniaca di origine renale dall’urina alla circolazione sistemica, la formazione di calcoli e la colica ureterale che causano la precipitazione di sali di fosfato di calcio nelle urine alcaline, il peggioramento dell’acidosi metabolica o respiratoria e la riduzione del tasso di escrezione urinaria di basi organiche deboli sono altri effetti avversi degli inibitori della CA.

L’efficacia degli inibitori della CA come agenti singoli è bassa e l’utilità a lungo termine degli inibitori della CA è spesso compromessa dallo sviluppo di processi di compensazione come l’acidosi metabolica. Inoltre, l’uso continuo di inibitori della CA può comportare una diminuzione dell’effetto terapeutico desiderato. L’acetazolamide ha rappresentato l’1,4% dei risultati positivi per i diuretici nel 2008 (WADA, 2009a).

• Inibitori del co-trasportatore Na+/K+/2Cl- (diuretici dell’ansa):

Gli inibitori del co-trasportatore Na+/K+/2Cl- (Figura 1B) sono una classe di diuretici a breve durata d’azione molto potenti che si legano al sito di legame del Cl- situato nel dominio transmembrana del co-trasportatore Na+/K+/2Cl-, che si trova nell’arto ascendente spesso dell’ansa di Henle (Figura 2C). Il blocco della funzione di questo simpatizzante determina una significativa riduzione della capacità del rene di concentrare l’urina e un conseguente aumento significativo dell’escrezione urinaria di Na+ e Cl-. Si verifica anche un marcato aumento dell’escrezione di Ca2+, Mg2+ e K+. Anche l’escrezione di acido urico aumenta con la somministrazione acuta, mentre la somministrazione cronica ha l’effetto opposto.

Gli inibitori del co-trasportatore Na+/K+/2Cl- sono la Furosemide, la Bumetanide, l’Acido Etacrinico, la Torsemide, l’Assosemide, la Piretanide e la Tripamide (strutture illustrate nella Figura 1B). Oltre il 90% dei farmaci si lega alle proteine plasmatiche. Sono assorbiti rapidamente e ampiamente dal tratto gastrointestinale (65-90%), ma hanno un’emivita molto breve (meno di 1 ora per Bumetanide e Piretanide e un massimo di 3,5 ore per la Torsemide). Questi inibitori del simporto subiscono un parziale metabolismo (epatico per Bumetanide e Torsemide, Glucuronazione renale per gli altri) con escrezione renale come farmaci intatti (Shankar e Brater, 2003).

A causa della loro struttura a base di Sulfonamidi, alcuni diuretici dell’ansa hanno una debole attività inibitoria della CA che aumenta ulteriormente l’effetto diuretico di questi farmaci. Inoltre, hanno effetti vascolari diretti (Dormans et al., 1996) che aumentano acutamente la capacità venosa sistemica e riducono la pressione di riempimento del ventricolo sinistro. Questo effetto, particolarmente evidente per la furosemide, giova ai pazienti con edema polmonare anche prima che si verifichi la diuresi.

Una delle principali indicazioni dei diuretici dell’ansa è il trattamento dell’edema polmonare acuto. Vengono utilizzati anche per il trattamento dell’insufficienza cardiaca congestizia cronica. Ciò comporta una significativa riduzione della mortalità, una diminuzione del rischio di peggioramento dell’insufficienza cardiaca e un miglioramento della capacità di esercizio (Faris et al., 2002). I diuretici dell’ansa sono anche ampiamente utilizzati per il trattamento dell’ipertensione (van der Heijden et al., 1998). Gli inibitori del simpatizzatore Na+/K+/2Cl- sono indicati anche nel trattamento dell’edema e dell’ascite della cirrosi epatica, nel trattamento dell’edema della sindrome nefrosica e per l’iponatriemia a rischio di vita.

Gli effetti avversi sono tutti correlati allo squilibrio di liquidi ed elettroliti. Essi comprendono iponatriemia e/o deplezione del volume del liquido extracellulare (associati a ipotensione, collasso circolatorio ed episodi tromboembolici), alcalosi ipocloremica, ipokaliemia (che induce aritmie cardiache), ipomagnesiemia, iperuricemia (che occasionalmente porta alla gotta) e iperglicemia. Inoltre, aumentano i livelli plasmatici di colesterolo e trigliceridi delle lipoproteine a bassa densità, mentre diminuiscono i livelli plasmatici di colesterolo delle lipoproteine ad alta densità. I diuretici ad ansa possono causare ototossicità, soprattutto l’Acido Etacrinico. Questa classe di diuretici presenta interazioni farmacologiche con diverse sostanze, tra cui Aminoglicosidi, anticoagulanti, glicosidi digitalici, Litio, Propranololo, Sulfoniluree, Cisplatino, Probenecid e Amfotericina B. Il sinergismo dell’attività diuretica dei diuretici dell’ansa e dei diuretici tiazidici associati porta a una diuresi profonda.

Nel 2008, gli inibitori del simpatizzatore Na+/K+/2Cl- hanno rappresentato il 24,6% dei campioni positivi al doping diuretico. La furosemide è stata il secondo diuretico più frequentemente rilevato, con 104 campioni positivi (23,9%) (WADA, 2009a).

• Inibitori del co-trasportatore Na+/Cl- (tiazidi e tiazidi-simili):

Gli inibitori del simpatizzatore Na+/Cl- (Figura 1C) hanno un’azione diuretica ottimale nel tubulo convoluto distale iniziale e un effetto diuretico minore nel tubulo prossimale. Inoltre, anche alcuni diuretici tiazidici sono deboli inibitori del CA. Riducono il riassorbimento di Na+ attraverso l’inibizione del co-trasporto Na+/Cl- (Figura 2D). Il legame di Na+ o Cl- al simpatizzatore Na+/Cl- modifica l’inibizione del simpatizzatore indotta dai tiazidici, suggerendo che il sito di legame dei tiazidici è condiviso o alterato sia dal Na+ che dal Cl- (Monroy et al., 2000).

Alcuni esempi di farmaci appartenenti a questa classe sono i seguenti (si veda la struttura nella Figura 1C): Bendroflumethiazide, Clorotiazide, Idroclorotiazide, Idroflumetiazide, Meticlorotiazide, Politiazide, Triclormetiazide, clortalidone, Indapamide, Metolazone e Chinetazone. In generale, tutti mostrano una buona biodisponibilità dopo somministrazione orale (100% per la Bendroflumetazide e la Politiazide, almeno il 50% per l’Idroflumetiazide e gli altri). Sono parzialmente metabolizzati da vie sconosciute e sono parzialmente escreti come farmaci intatti dal rene. Il legame con le proteine plasmatiche varia notevolmente tra i vari gruppi. Gli ampi intervalli di emivita variano da 1,5 h per la Clorotiazide a quasi 50 h per il Clortalidone.

Sebbene ci si aspetti che questa classe di diuretici aumenti notevolmente l’escrezione di Na+ e Cl-, questo effetto è moderato poiché circa il 90% del Na+ filtrato viene riassorbito prima di raggiungere il tubulo contorto distale. Come i diuretici dell’ansa, gli inibitori del co-trasportatore Na+/Cl- influenzano l’escrezione di K+ e di acido urico con gli stessi meccanismi; l’escrezione di K+ è marcatamente aumentata dopo la somministrazione e l’escrezione di acido urico è aumentata dopo la somministrazione acuta e diminuisce dopo la somministrazione cronica. Tuttavia, diminuiscono l’escrezione di Ca2+ (Friedman e Bushinsky, 1999).

I diuretici tiazidici sono i più utilizzati. Sono impiegati come terapia di prima linea per l’ipertensione, da soli o in combinazione con altri farmaci antipertensivi (Chobanian et al., 2003). Sono utilizzati anche per il trattamento dell’edema associato a malattie cardiache, epatiche e renali. I diuretici tiazidici sono frequentemente utilizzati per il loro basso costo, l’elevata tolleranza, la buona compliance (somministrazione una volta al giorno), le poche controindicazioni, l’efficacia paragonabile a quella di altre classi di agenti antipertensivi e i comprovati benefici nel ridurre la morbilità e la mortalità cardiovascolare.

Anche in questo caso, come per i diuretici dell’ansa, la maggior parte degli effetti avversi degli inibitori del simporto Na+/Cl- sono dovuti ad anomalie dell’equilibrio dei fluidi e degli elettroliti e comprendono: deplezione del volume extracellulare, ipotensione, ipokaliemia (che compromette l’effetto antipertensivo), iponatremia, ipocloremia, alcalosi metabolica, ipomagnesiemia, ipercalcemia, iperuricemia e iperglicemia (il diabete mellito latente può essere smascherato durante la terapia) (Wilcox et al. , 1999). Tuttavia, a differenza dei diuretici dell’ansa, gli inibitori della simporta Na+/Cl- aumentano i livelli plasmatici di colesterolo delle lipoproteine a bassa densità, colesterolo totale e trigliceridi totali e l’incidenza della disfunzione erettile è maggiore.

Le interazioni farmaco-diuretico tiazidico e tiazidico-simile causano una diminuzione dell’effetto degli anticoagulanti, degli agenti uricosurici, delle sulfoniluree e dell’insulina e aumentano gli effetti dovuti al sinergismo d’azione tra anestetici, diazossido, glicosidi digitalici, litio, vitamina D e diuretici dell’ansa.

Gli inibitori del co-trasportatore Na+/Cl- sono stati la classe di diuretici più abusata nel 2008 secondo le statistiche WADA, con il 38,7% dei campioni positivi. L’idroclorotiazide è stato il diuretico più rilevato, trovato nel 31,4% (137) dei campioni positivi (WADA, 2009a).

• Diuretici osmotici:

I diuretici osmotici sono una classe di composti non metabolizzabili a basso peso molecolare. Solo quattro composti sono inclusi in questa classe di diuretici: Glicerina, Isosorbide, Mannitolo e Urea. Le strutture molecolari sono riportate nella Figura 1D. Questi composti sono relativamente inerti dal punto di vista farmacologico, liberamente filtrabili dal glomerulo e non diffondibili attraverso il nefrone. Vengono somministrati in dosi elevate, non solo per via orale (Glicerina, Isosorbide) ma anche per via endovenosa (Mannitolo, Urea). Tale somministrazione aumenta significativamente l’osmolalità del plasma e del fluido tubulare e, a sua volta, provoca un aumento dell’osmolalità delle urine con conseguente riduzione del riassorbimento di acqua nel nefrone distale/dotti collettori. I diuretici osmotici agiscono sia nel tubulo prossimale che nell’ansa di Henle, con quest’ultima come sito d’azione principale. Questi diuretici agiscono anche attraverso un effetto osmotico nei tubuli e riducendo la tonicità midollare. Le emivite variano da meno di 1 ora nel caso della Glicerina e del Mannitolo a quasi 10 ore per l’Isosorbide.

Estraendo acqua dai compartimenti intracellulari, i diuretici osmotici espandono il volume del fluido extracellulare, riducono la viscosità del sangue e inibiscono il rilascio di renina. Ne consegue un aumento dell’escrezione urinaria di tutti gli elettroliti, Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, HCO3- e PO43-. Il loro uso è limitato a situazioni cliniche ben definite; ad esempio, il mannitolo viene utilizzato per ridurre l’edema cerebrale e la massa cerebrale prima e dopo un intervento di neurochirurgia, nella necrosi tubulare acuta come protettore renale (Levinsky e Bernard, 1988) e per il trattamento della sindrome da disequilibrio dialitico. Poiché i diuretici osmotici estraggono acqua dall’occhio e dal cervello, sono tutti utilizzati per controllare la pressione intraoculare durante gli attacchi acuti di glaucoma e nella chirurgia oculare.

La terapia diuretica osmotica può causare ipernatremia e disidratazione a causa della perdita di acqua in eccesso rispetto alla perdita di elettroliti. Al contrario, il loro uso può portare all’iponatriemia, responsabile dei comuni effetti avversi (cefalea, nausea e vomito). L’iperglicemia può verificarsi come conseguenza del metabolismo della glicerina.

• Inibitori dei canali Na+ dell’epitelio renale:

Gli inibitori dei canali Na+ dell’epitelio renale (Figura 1E) agiscono nelle cellule del tubulo distale tardivo e del dotto collettore del nefrone inibendo il riassorbimento di Na+ e la secrezione di K+ e H+ (Figura 2E). Il meccanismo molecolare è il blocco dei canali epiteliali del Na+ nella membrana luminale attraverso la competizione con il Na+ per le aree cariche negativamente all’interno del poro del canale del Na+.

Gli unici due farmaci di questa classe in uso clinico sono il Triamterene e l’Amiloride (strutture illustrate anche nella Figura 1E). Entrambi i farmaci mostrano un modesto effetto diuretico da soli e un piccolo aumento dell’escrezione di Na+ e Cl-. In genere, vengono utilizzati in combinazione con altri diuretici per compensare i loro gravi effetti kaliuretici e preservare i livelli di potassio nei pazienti a rischio di ipokaliemia. Nel trattamento dell’edema o dell’ipertensione, la combinazione di un inibitore dei canali del Na+ con un diuretico tiazidico o dell’ansa potenzia l’effetto diuretico e antipertensivo.

Gli inibitori dei canali del Na+ mostrano una bassa biodisponibilità orale e grandi differenze nell’emivita (più di 20 ore per l’amiloride, meno di 5 ore per il triamterene). La via di eliminazione è prevalentemente renale per l’Amiloride intatta, mentre il Triamterene viene ampiamente metabolizzato nel 4-idrossitriamterene solfato attivo ed escreto nelle urine. Gli effetti avversi più comuni degli inibitori dei canali del Na+ sono nausea, vomito, diarrea, cefalea, crampi alle gambe e vertigini. L’effetto avverso più pericoloso degli inibitori dei canali del Na+ è l’iperkaliemia. Il Triamterene può anche ridurre la tolleranza al glucosio e indurre fotosensibilizzazione.

L’Amiloride e il Triamterene sono stati rilevati nel 3% dei campioni positivi al doping diuretico nel 2008 (WADA, 2009a).

• Antagonisti dei recettori dei mineralcorticoidi

Gli antagonisti dei recettori dei mineralcorticoidi (Figura 1F) sono inibitori competitivi dell’Aldosterone che si legano e inibiscono gli MR citosolici presenti nelle cellule epiteliali del tubulo distale tardivo e del dotto collettore del nefrone (Figura 2E).

Il MR è un membro della superfamiglia dei recettori nucleari per gli steroidi. Normalmente, l’Aldosterone entra nella cellula epiteliale e si lega ai MR. Il complesso MR-aldosterone trasloca poi nel nucleo dove si lega a specifiche sequenze di DNA (elementi responsivi all’ormone), regolando così l’espressione di molteplici prodotti genici chiamati proteine indotte dall’aldosterone. A differenza del complesso MR-aldosterone, il complesso MR-antagonista non è in grado di indurre la sintesi di proteine indotte dall’aldosterone.

I composti appartenenti a questa classe (vedi anche Figura 1F per le strutture molecolari) sono, ad esempio, lo Spironolattone, il Canrenone, il Canrenoato di Potassio e l’Eplerenone. La disponibilità orale dello Spironolattone, la molecola prototipo della classe, è di circa il 65%; è ampiamente metabolizzato, subisce un ricircolo enteroepatico, si lega fortemente alle proteine plasmatiche e ha un’emivita breve (circa 1,6 h) (Beermann, 1984). Il Canrenone è un metabolita attivo dello Spironolattone con un’emivita 10 volte superiore (16,5 h) che prolunga l’effetto del composto madre. Il Canrenoato non è attivo, ma viene convertito in Canrenone nell’organismo. L’Eplerenone ha una buona disponibilità orale ed è ampiamente metabolizzato.

Gli antagonisti dei recettori dei mineralcorticoidi hanno effetti sull’escrezione urinaria simili a quelli degli inibitori dei canali Na+ dell’epitelio renale. L’efficacia clinica degli antagonisti dei MR dipende strettamente dai livelli endogeni di Aldosterone; livelli più elevati provocano effetti maggiori.

Questo gruppo di diuretici è molto utile come alternativa alla terapia sostitutiva del potassio. Di solito vengono impiegati in caso di elevate concentrazioni di potassio. Nel trattamento dell’edema e dell’ipertensione, questi farmaci vengono spesso co-somministrati con i diuretici tiazidici o dell’ansa, oltre che con gli altri diuretici risparmiatori di K+. Lo spironolattone è utile nel trattamento dell’iperaldosteronismo primario e dell’edema refrattario associato all’aldosteronismo secondario (Ouzan et al., 2002). Analogamente agli inibitori dei canali del Na+, l’effetto avverso più comune degli antagonisti del MR è l’iperkaliemia.

A causa della sua struttura molecolare (Figura 1F), lo Spironolattone ha una certa affinità per i recettori del Progesterone e degli Androgeni che causa alcuni effetti collaterali come ginecomastia, impotenza e irregolarità mestruali. Al contrario, grazie al gruppo 9,11-epossido, l’Eplerenone ha un’affinità molto bassa per i Recettori del Progesterone e degli Androgeni (<1% e <0,1%, rispettivamente) rispetto allo Spironolattone. La somministrazione cronica di Spironolattone può indurre tumori maligni; in particolare, è stato osservato il cancro al seno. Per quanto riguarda le interazioni farmaco-farmaco, i salicilati riducono la secrezione tubulare di Canrenone e diminuiscono l’efficacia diuretica dello Spironolattone, mentre quest’ultimo altera la clearance dei glicosidi digitalici.

Canrenone e Spironolattone insieme hanno rappresentato il 4,3% dei campioni positivi al doping diuretico nel 2008 (WADA, 2009a).

Diuretici e Sport:

• Osservazioni generali

Come già detto, i diuretici sono comunemente prescritti in medicina clinica per il trattamento dell’ipertensione e di altri disturbi cardiovascolari. Questi composti sono anche frequentemente utilizzati in modo illecito nello sport. I diuretici sono vietati in tutti gli sport perché possono causare una rapida perdita di peso e possono agire come agenti mascheranti (per nascondere gli effetti di altre sostanze proibite) sia in gara che fuori. Tuttavia, il Codice Mondiale Antidoping (WADA, 2009f) consente l’uso terapeutico dei diuretici quando gli atleti e i loro medici richiedono un’esenzione per uso terapeutico (TUE) secondo lo Standard Internazionale per le TUE (WADA, 2009d). La TUE è definita come “l’autorizzazione all’uso, a scopo terapeutico, di sostanze o metodi contenuti nella Lista delle sostanze o dei metodi proibiti, ogni volta che viene approvata da un Comitato per l’esenzione dall’uso terapeutico sulla base di un dossier medico documentato prima dell’uso della sostanza nello sport”. Per i diuretici, l’uso terapeutico principale consentito è quello per l’ipertensione (WADA, 2008b). Va notato che una TUE non è valida se l’urina di un atleta contiene un diuretico in associazione a un livello soglia o sotto-soglia di un’altra sostanza esogena inclusa nella Lista proibita. Grazie alla TUE, alcuni atleti fanno uso di diuretici per scopi medici legittimi; in molti casi, tuttavia, l’uso di diuretici è illecito (Clarkson e Thompson, 1997).

• DOPING e Diuretici

Ragionevolmente, l’uso più efficace dei diuretici nel doping sportivo sarebbe prima di un test antidoping. I diuretici aumentano il volume delle urine e diluiscono gli agenti dopanti e i loro metaboliti presenti nelle urine, rendendone più problematica l’individuazione da parte delle analisi antidoping convenzionali. Per questo motivo, i diuretici sono classificati come agenti mascheranti nella Lista proibita della WADA (classe S5: “Diuretici e altri agenti mascheranti”) (WADA, 2009b).

Sebbene vi siano poche prove di un miglioramento delle prestazioni atletiche in seguito alla somministrazione di diuretici, il loro abuso è molto diffuso tra gli atleti che vogliono perdere peso rapidamente. Ad esempio, l’uso di diuretici può consentire a un atleta di ridurre transitoriamente il peso corporeo, il che rappresenta un chiaro vantaggio nella lotta, nel pugilato, nel judo e nel sollevamento pesi, nonché negli sport in generale in cui sono coinvolte categorie di peso e tra gli atleti che desiderano mantenere un peso corporeo basso, come le ginnaste e le ballerine. Gli sciatori e gli alpinisti, tuttavia, fanno un uso legittimo dell’acetazolamide (un inibitore della CA che agisce anche su siti diversi dal rene) per prevenire l’AMS.

Come già detto, i diuretici sono vietati nello sport perché possono essere utilizzati: (i) direttamente, per produrre una rapida perdita di peso che può essere fondamentale per raggiungere una categoria di peso negli eventi sportivi; e/o (ii) indirettamente, per alterare il normale profilo di metabolismo/escrezione di altre sostanze dopanti. In entrambi i casi, discussi più dettagliatamente in seguito, la somministrazione di diuretici può essere acuta o cronica, con dosi somministrate che possono superare notevolmente i livelli terapeutici. In generale, gli atleti possono utilizzare i diuretici in una singola dose alcune ore prima di una gara (ad esempio, lottatori o sportivi a scopo di mascheramento) o abusarne cronicamente per mesi (ad esempio, ginnaste). È importante notare che i diuretici di cui gli atleti abusano maggiormente (furosemide, idroclorotiazide e triamterene) hanno un’emivita breve e sono quindi non rilevabili nelle urine se i campioni non vengono raccolti entro 24-48 ore dall’ultima somministrazione.

• Diuretici, esercizio fisico e perdita di peso

Nel tentativo di valutare l’importanza dell’uso di diuretici nella perdita di peso, Caldwell et al. (1984) hanno confrontato il diverso effetto della disidratazione acuta indotta dall’esercizio fisico, dalla sauna e dai diuretici sulla variazione di peso. I risultati hanno mostrato una diminuzione di 2,3 ± 0,8 kg dopo l’esercizio fisico, 3,5 ± 0,8 kg dopo la sauna e 3,1 ± 0,8 kg dopo la somministrazione di furosemide. Inoltre, i bodybuilder abusano di diuretici insieme a steroidi androgeno-anabolizzanti per accentuare la definizione muscolare e il tono corporeo. Nello stesso studio riportato da Caldwell et al. è stato dimostrato che la variazione del volume plasmatico negli atleti è pari a -0,9% dopo l’esercizio fisico, -10,3% dopo la sauna e -14,1% dopo la somministrazione di furosemide (quantità totale di 1,7 mg-kg-1 in due dosi divise, 16 ore prima del test) (Caldwell et al., 1984).

I diuretici possono avere diversi effetti fisiologici sulla fisiologia dell’esercizio, tra cui effetti sul metabolismo (termoregolazione, omeostasi del potassio), sul sistema cardiovascolare e sul sistema respiratorio [azioni polmonari, assorbimento di ossigeno (VO2)]. La maggior parte degli effetti è legata alle conseguenze della deplezione di volume e dello squilibrio e della deplezione di elettroliti. L’esercizio fisico può influenzare anche l’azione dei diuretici, con conseguenze sia sulla farmacologia che sulla farmacocinetica. A livello del nefrone, l’esercizio fisico può sia integrare che antagonizzare gli effetti dei diuretici. L’esercizio fisico induce acutamente un bilancio idrico negativo e l’esercizio fisico regolare a lungo termine abbassa la pressione sanguigna, aumentando le proprietà farmacologiche dei diuretici (Zappe et al., 1996). L’esercizio fisico influenza anche le azioni specifiche dei diuretici; può causare uno spostamento acuto del potassio intracellulare nello spazio intravascolare (Young et al., 1992) e potenziare l’effetto kaliuretico dei diuretici. Mentre i diuretici tiazidici sono associati all’insulino-resistenza (Moser, 1998), l’esercizio fisico potenzia l’effetto opposto (Plasqui e Westerterp, 2007). Nella maggior parte dei casi, l’esercizio fisico viene utilizzato come terapia per l’insulino-resistenza perché attiva le cellule β pancreatiche attraverso il sistema neuroadrenergico (Bordenave et al., 2008). Questo riduce i livelli di insulina nel sangue e di conseguenza aumenta il rilascio epatico di glucosio e diminuisce l’utilizzo muscolare dell’insulina (Bonen et al., 2006). Sebbene vi siano poche informazioni su come l’esercizio fisico influisca sulla farmacocinetica dei diuretici, clorotiazide, idroclorotiazide e triamterene hanno un’emivita di eliminazione abbastanza breve (1,5-4 ore) da essere influenzata da 1 ora o più di esercizio fisico prolungato (Somani, 1996), che riduce il flusso sanguigno renale ed epatico. Pertanto, queste sostanze non vengono sempre rilevate nei campioni di urina raccolti dopo una gara o al termine di un’intensa sessione di allenamento. È da notare che sia l’esercizio fisico sia i diuretici possono causare indipendentemente la perdita di liquidi ed elettroliti. La Tabella 2, adattata da Caldwell et al. (1984) e Reents (2000), riassume gli effetti dell’esercizio e dei diuretici sulla fisiologia renale.

È noto che durante l’esercizio fisico la temperatura del muscolo scheletrico supera la temperatura interna entro alcuni minuti, e l’alterazione dei sistemi termoregolatori dell’organismo è uno dei rischi principali dell’abuso di diuretici. La marcata disidratazione conseguente all’assunzione di diuretici esercita un effetto dannoso sui sistemi cardiovascolare e termoregolatorio dell’organismo durante l’esercizio e può portare a esaurimento, battito cardiaco irregolare, infarto e morte. È stato dimostrato che sia l’acetazolamide (Brechue e Stager, 1990), un leggero diuretico, sia la furosemide (Claremont et al., 1976), un potente diuretico, compromettono l’aumento adattativo del flusso sanguigno cutaneo durante l’esercizio.

I diuretici influenzano l’omeostasi del potassio nel muscolo in esercizio; il potassio intracellulare e il potenziale di membrana a riposo della cellula diminuiscono entrambi. Tutti i diuretici, tranne gli agenti risparmiatori di potassio, aumentano la kaliuresi, accelerando la deplezione del potassio intracellulare. L’ipokaliemia che ne consegue può portare a crampi muscolari e ad aritmie cardiache secondarie a spostamenti/perdite di elettroliti. D’altra parte, l’uso eccessivo di diuretici risparmiatori di potassio, come lo spironolattone, il triamterene e l’amiloride, può portare all’iperkaliemia e di conseguenza esporre gli atleti ad aritmie maligne (Appleby et al., 1994). Inoltre, l’interferenza della maggior parte dei diuretici con il metabolismo dell’acido urico può causare un attacco di gotta, che può essere molto doloroso (Koutlianos e Kouidi, 2006).

La disidratazione indotta dai diuretici influenza la frequenza cardiaca da sforzo. In particolare, a bassa intensità di esercizio risulta una frequenza cardiaca più elevata, mentre durante lo sforzo massimale l’effetto è minore o quasi assente (Stager et al., 1990). Ciò è particolarmente vero per l’abuso di acetazolamide (Brechue e Stager, 1990) e, in misura minore, di furosemide (Claremont et al., 1976). Studi condotti sugli inibitori della CA e sui diuretici tiazidici hanno dimostrato che dopo la somministrazione di acetazolamide (Brechue e Stager, 1990) o di una combinazione idroclorotiazide-triamterene (Nadel et al., 1980) il volume plasmatico e il volume dell’ictus sono significativamente diminuiti. La perdita di volume plasmatico e di volume del battito interrompe la termoregolazione attraverso la vasodilatazione periferica (raffreddamento per irraggiamento) e la sudorazione (raffreddamento per evaporazione), compromettendo la risposta vasodilatatoria fisiologica sia acuta che a lungo termine all’esercizio aerobico. Inoltre, gli antagonisti dell’aldosterone, in particolare lo spironolattone, interferiscono con l’aumento della sensibilità dei recettori dell’aldosterone dovuto all’ipervolemia indotta dall’esercizio (una conseguenza del normale adattamento all’esercizio fisico regolare).

• Effetti aggiuntivi di classi specifiche di diuretici

Poiché la CA svolge un ruolo chiave nei meccanismi di regolazione acido-base, gli inibitori della CA sono l’unica classe di diuretici che può influenzare la funzione polmonare. È stato dimostrato che l’acetazolamide compromette l’eliminazione di CO2 durante l’esercizio fisico (Scheuermann et al., 1999), ma anche l’efflusso di CO2 dal muscolo inattivo (Kowalchuk et al., 1992). Nell’AMS, l’acetazolamide migliora l’ossigenazione alveolare aumentando le pressioni arteriose di ossigeno e abbassando le pressioni arteriose di anidride carbonica (Bradwell et al., 1986). Gli effetti metabolici cellulari dell’acetazolamide possono prevalere sui suoi effetti polmonari e causare un’inibizione del VO2 durante l’esercizio massimale (Stager et al., 1990; Kowalchuk et al., 1992). La furosemide diminuisce il volume tidalico, la ventilazione minima e il rapporto di scambio respiratorio alla soglia aerobica (Caldwell et al., 1984). Al contrario, i dati clinici indicano che la furosemide inalata riduce la broncocostrizione indotta dall’esercizio fisico nei bambini asmatici (Munyard et al., 1995). Gli effetti dei diuretici sul VO2 sono variabili. La furosemide provoca un effetto dose-dipendente; a basse dosi non ha alcuna influenza sul VO2 (Armstrong et al., 1985; Baum et al., 1986), ma il VO2 diminuisce significativamente a dosi più elevate (Caldwell et al., 1984). L’acetazolamide influisce sul VO2 solo durante l’esercizio massimale (Stager et al., 1990; Kowalchuk et al., 1992), poiché il VO2 non è influenzato in condizioni di normossia (Brechue e Stager, 1990), ma è notevolmente migliorato in condizioni di ipossia (Schoene et al., 1983). Gli effetti dell’acetazolamide sulle prestazioni dipendono dall’altitudine; a livello del mare (Heigenhauser et al., 1980) e in condizioni di normossia (Schoene et al., 1983; Stager et al., 1990) può compromettere le prestazioni aerobiche, ma in condizioni di ipossia diminuisce il tempo di esaurimento durante l’esercizio submassimale (Stager et al., 1990).

Infine, i diuretici tiazidici sono derivati dei sulfamidici e possono causare fotosensibilità se si pratica attività fisica all’aperto nelle ore di mezzogiorno.

Caldwell et al. hanno condotto uno studio sulla riduzione del carico di lavoro ciclistico indotta da diuretici per valutare gli effetti dell’ipoidratazione sulle prestazioni al cicloergometro. In questo studio, il VO2 max (massimo assorbimento di ossigeno) e il carico di lavoro in bicicletta diminuiscono negli atleti dopo l’assunzione di furosemide. Anche dopo la reidratazione, la resistenza muscolare e le prestazioni sono notevolmente compromesse dall’uso di diuretici (Caldwell et al., 1984). Ulteriori studi condotti su corridori di media distanza (Armstrong et al., 1985) e lottatori (Caldwell, 1987) hanno confermato che i diuretici riducono gli effetti sulla prestazione atletica complessiva. Sebbene non siano disponibili dati sufficienti per stabilire l’effetto del trattamento diuretico a lungo termine sulla capacità di esercizio, è stato chiaramente dimostrato che il trattamento diuretico a dose singola e a breve termine influisce negativamente sulla capacità di esercizio massimale e sulla durata dell’esercizio submassimale prolungato (Fagard et al., 1993). Per la moltitudine di ragioni sopra menzionate, gli svantaggi legati alla somministrazione di diuretici superano i potenziali vantaggi della riduzione del peso e della diluizione delle urine; la disidratazione compromette drasticamente la capacità aerobica e la forza muscolare e riduce l’efficienza metabolica. Ciò si traduce in un effetto negativo sulla capacità complessiva di praticare sport ed esercizio fisico e soprattutto sulle prestazioni atletiche (Caldwell et al., 1984; Armstrong et al., 1985). Inoltre, un potenziale effetto dell’abuso di diuretici è la possibile alterazione della dimensione della filtrazione glomerulare, che dipende da una serie di parametri (Edwards et al., 1999), la maggior parte dei quali può essere marcatamente influenzata dal meccanismo d’azione delle diverse classi di diuretici. Infine, va notato che la squalifica dalle competizioni e gli altri effetti dannosi precedentemente menzionati dell’abuso di diuretici compensano qualsiasi beneficio percepito.

Sebbene molti degli studi sopra citati siano stati pubblicati negli anni ’80 e ’90, i diuretici sono ancora ampiamente abusati nello sport (e sono tra gli agenti terapeutici più prescritti). Pochi studi sugli effetti dei diuretici sugli atleti sono stati pubblicati di recente, perché negli ultimi tempi la maggior parte degli studi che valutano gli agenti dopanti e l’esercizio fisico e lo sport si sono concentrati su farmaci e metodi di miglioramento delle prestazioni più recenti. L’uso di diuretici per mascherare altre sostanze proibite rimane comunque un problema serio.

Analisi dei diuretici

• Osservazioni generali

Per la rilevazione dei diuretici nelle urine nell’ambito del doping sportivo, la WADA ha fissato un unico livello minimo di prestazione richiesto (MRPL) di 250 ng-mL-1 per i laboratori accreditati (WADA, 2009e). Anche se le potenze relative, il metabolismo e le proprietà di eliminazione variano notevolmente (e determinano livelli urinari diversi) tra le classi di diuretici (Tabella 3), l’MRPL di 250 ng-mL-1 è sufficiente per rilevare l’abuso acuto di diuretici da parte degli atleti. È probabile che dosaggi inferiori di diuretici non siano sufficienti a provocare l’effetto di mascheramento o la drastica e acuta perdita di peso ricercata da chi abusa di diuretici.

Per l’analisi dei diuretici sono state proposte diverse tecniche analitiche, tra cui principalmente HPLC-UV-DAD, GC/MS, LC/MS e LC/MS-MS, cromatografia elettrocinetica micellare ed elettroforesi capillare. Tuttavia, la soluzione migliore per un metodo di screening completo in grado di rilevare la presenza in un campione biologico di qualsiasi diuretico, soddisfacendo al contempo l’MRPL fissato dalla WADA, è rappresentata dai metodi basati su GC/MS, LC/MS e LC/MS-MS. In genere, l’uso di strumentazioni GC/MS, LC/MS e LC/MS-MS consente di rilevare i composti progenitori dei diuretici e/o i metaboliti più diagnostici e abbondanti. Tuttavia, in alcuni casi, l’analita target può non essere il composto progenitore o i suoi metaboliti, ma uno o più prodotti di degradazione formati dopo l’idrolisi dei diuretici in ambiente acquoso. Questo è il caso dei diuretici tiazidici, tra cui soprattutto l’idroclorotiazide e l’altiazide. Questo fenomeno è più rilevante quando c’è un ritardo tra la raccolta del campione e l’analisi di laboratorio (Thieme et al., 2001; Goebel et al., 2004; Deventer et al., 2009).

Negli anni ’80 e ’90, la GC/MS era la tecnica analitica più comunemente utilizzata dai laboratori antidoping per l’analisi degli xenobiotici nelle urine (Maurer, 1992; Hemmersbach e de la Torre, 1996). Storicamente, anche i diuretici venivano analizzati con la GC/MS [ampiamente rivista da Ventura e Segura, 1996 (Ventura & Segura, 1996)]. La recente evoluzione verso la LC/MS (vedi sotto) è stata guidata da una serie di cause concomitanti che rendono l’approccio basato sulla GC/MS meno preferibile rispetto a quello degli ultimi due decenni: (i) il numero di sostanze target, e in particolare di xenobiotici a basso peso molecolare, da sottoporre a screening nelle analisi antidoping è aumentato drasticamente nel periodo 2002-2007, promuovendo lo sviluppo di tecniche analitiche più “universali” volte a ridurre il rapporto risorse/test; (ii) la necessità di semplificare il pretrattamento dei campioni a causa dell’aumento del numero di procedure analitiche eseguite contemporaneamente nei laboratori antidoping; e (iii) i progressi tecnologici nel campo della strumentazione analitica e, più specificamente, la disponibilità di sistemi LC/MS e LC/MS-MS da banco a un prezzo accessibile. Tutti questi eventi hanno favorito il progressivo passaggio dalla GC/MS alla LC/MS.

• Gascromatografia/spettrometria di massa:

La gascromatografia/spettrometria di massa è ancora utilizzata da molti laboratori antidoping e può ancora rappresentare una valida alternativa per l’analisi antidoping dei diuretici. Una procedura analitica generale basata sulla GC/MS è strutturata come una serie di fasi di pretrattamento (come minimo: estrazione dei diuretici dalla matrice biologica e derivatizzazione chimica) da eseguire prima della corsa cromatografica.

Pretrattamento del campione Come è noto, l’analisi GC/MS di campioni biologici per lo screening dei diuretici richiede una serie di procedure prestrumentali volte a rendere il campione adatto all’analisi. Fondamentalmente, le fasi critiche sono rappresentate dall’estrazione dei diuretici dalla matrice biologica e dalla derivatizzazione chimica eseguita per aumentare la volatilità e la stabilità termica dei composti target.
Sono stati pubblicati diversi metodi per la rilevazione dei diuretici nelle urine utilizzando procedure di estrazione liquido/liquido (L/L) e fase solida (SPE). La SPE può consentire il recupero dei diuretici con rese più elevate, ma allo stesso tempo l’uso di cartucce monouso aumenta il costo complessivo della procedura di pretrattamento, soprattutto nel caso di supporti più complessi, come i supporti a superficie interna in fase inversa (ISRP-size exclusion).

Le colonne pre-attivate disponibili in commercio sono state testate per la loro efficacia e la scelta migliore dovrebbe dipendere dalle caratteristiche della matrice e dalla composizione prevista del campione [rivista da Ventura e Segura nel 1996 (Ventura e Segura, 1996)].

D’altra parte, l’estrazione L/L richiede generalmente più procedure di estrazione. Quando si desidera rilevare tutti i diuretici (basici, acidi e neutri), la soluzione ottimale è un processo basato su due procedure di estrazione L/L separate (una in mezzo neutro o basico e un’altra in mezzo acido) utilizzando acetato di etile o una miscela di solventi organici. È possibile aggiungere solfato di sodio anidro per favorire l’effetto di salatura. Particolare attenzione deve essere dedicata allo studio dei potenziali processi di degradazione che potrebbero coinvolgere i composti target. È stata dimostrata l’ossidazione dei tiazidi (althiazide, benzthiazide e politiazide) in presenza di acetato di etile, pertanto è necessario valutare preliminarmente l’efficacia e la non reattività di diversi solventi di estrazione.

In alcuni casi, due o più fasi di pretrattamento possono essere combinate, come nel caso della metilazione estrattiva in cui sia l’estrazione che la derivatizzazione sono combinate in un’unica procedura.

• Procedure di derivatizzazione

Come già detto, la derivatizzazione è necessaria prima dell’analisi GC/MS, poiché la maggior parte dei diuretici non è sufficientemente volatile, lipofila o termicamente stabile per essere analizzata direttamente con questa tecnica analitica. Le procedure di derivatizzazione più comuni sono la sililazione e la metilazione, ma quest’ultima è solitamente preferita in quanto consente di ottenere rese sufficienti di derivati più stabili per la maggior parte dei diuretici [rivisto da Carreras et al. nel 1994 (Carreras et al., 1994)]. La metilazione può essere eseguita “staticamente” (con una miscela di ioduro di metile e acetone sotto riscaldamento termico) o “dinamicamente” mediante metilazione estrattiva (Lisi et al., 1991; Lisi et al., 1992) o metilazione “in colonna” (flash methylation) (Beyer et al., 2005). Quando la metilazione viene eseguita con un processo autonomo, il tempo può essere drasticamente ridotto dall’irradiazione a microonde, in combinazione o in alternativa all’incubazione termica (Amendola et al., 2003).

Condizioni cromatografiche e spettrometriche La fase stazionaria migliore per l’analisi dei composti diuretici è il fenilmetilsilicone, che consente di separare efficacemente tutti i diuretici in tempi ragionevoli (<15 min). Tempi drasticamente più brevi possono essere ottenuti con sistemi fast-GC, in cui vengono accoppiate con successo colonne di ultima generazione e rivelazione spettrometrica di massa basata su un’elettronica veloce. I sistemi Fast-GC consentono di ridurre di 10 volte la durata complessiva della corsa cromatografica (Morra et al., 2006). La ionizzazione a impatto elettronico e la rivelazione MS sono i metodi più descritti [rivisti in Ventura e Segura, 1996 e da Müller et al. nel 1999 (Ventura e Segura, 1996; Müller et al., 1999)]. Gli spettri di massa dei derivati metilici dei diuretici sono stati descritti da diversi autori e i profili di frammentazione sono stati interpretati anche per confronto con i derivati metilici deuterati (Yoon et al., 1990).

• Cromatografia liquida/spettrometria di massa

Quando i diuretici sono stati introdotti nell’elenco delle sostanze proibite dalle autorità sportive internazionali, i primi tentativi di creare un metodo di screening per il loro rilevamento si sono basati sull’HPLC. All’epoca, come rivelatore fu utilizzato un diode array UV che facilitava l’identificazione dei picchi (Ventura e Segura, 1996). Secondo i requisiti del CIO/WADA, le procedure di conferma necessarie per sostenere un caso positivo devono basarsi sulla MS. Per questo motivo, nella maggior parte dei casi, la tecnica scelta è stata un metodo GC/MS dopo metilazione dei composti. Per i motivi illustrati nelle sezioni precedenti, alla fine degli anni ’90, quando sono diventati disponibili strumenti LC/MS più robusti, affidabili ed economici, sono stati introdotti importanti cambiamenti nelle strategie di rilevamento dei diuretici nel campo del doping. I primi tentativi di utilizzare la LC/MS per la rilevazione dei diuretici sono iniziati all’inizio degli anni ’90, utilizzando interfacce termospray o a fascio di particelle (Ventura et al., 1991) nelle analisi di conferma. La mancanza di robustezza delle apparecchiature non consentiva un metodo di screening quotidiano basato su questi strumenti.

Thieme et al. (Thieme et al., 2001) hanno descritto un metodo per l’analisi di 32 diuretici nelle urine umane mediante LC/MS/MS utilizzando una tecnica di ionizzazione electrospray. Questa tecnica ha il vantaggio di poter utilizzare le tradizionali velocità di flusso LC e le colonne LC a fase inversa (colonne di ottadecilsilano-ODS con particelle di 5 o 3 µm) solitamente utilizzate nei metodi LC-UV. Inoltre, è possibile utilizzare contemporaneamente le modalità di ionizzazione positiva e negativa, consentendo la rilevazione di composti acidi e basici inclusi tra i diuretici. L’analisi mediante MS tandem con quadrupoli a triplo stadio è risultata sufficientemente selettiva e sensibile rispetto ai metodi precedenti e ha reso possibile la semplificazione della preparazione dei campioni, in quanto la pulizia degli estratti urinari era meno critica rispetto ai metodi LC-UV progettati in precedenza.

Lo sviluppo di nuovi analizzatori (trappole ioniche) accoppiati alla LC ha creato ulteriori alternative per l’analisi dei diuretici mediante LC/MS (Deventer et al., 2002). Ancora più recentemente, la necessità di strategie più universali per l’analisi degli agenti dopanti ha introdotto l’uso di analizzatori time-of-flight (Georgakopoulos et al., 2007) che possono essere accoppiati alla LC. Per alcuni composti e ai fini dell’identificazione, la ionizzazione mediante ionizzazione chimica a pressione atmosferica (un’altra possibile tecnica di ionizzazione delle interfacce LC/MS) è interessante in quanto produce una frammentazione aggiuntiva (Qin et al., 2003).

La selettività e la sensibilità di queste tecniche hanno permesso di includere nelle stesse procedure di screening anche altre droghe non diuretiche, anch’esse vietate nello sport (Deventer et al., 2005; Mazzarino et al., 2008). Inoltre, sono stati esplorati diversi approcci per la preparazione dei campioni. In passato, le classiche doppie estrazioni con solventi organici a pH acido e basico venivano utilizzate per consentire il recupero di diuretici con proprietà fisico-chimiche diverse.

Le nuove caratteristiche degli strumenti e l’estensione dei metodi di screening ad altri composti ampliano le possibilità di preparazione dei campioni. Specifiche procedure SPE possono essere eseguite in sistemi robotici (Goebel et al., 2004) e alcune procedure analitiche non richiedono alcuna preparazione del campione, ma solo una diluizione del campione di urina e la successiva iniezione diretta nel sistema LC/MS (Politi et al., 2007; Thorngren et al., 2008). I miglioramenti nella velocità di scansione degli spettrometri di massa, così come le colonne LC e le pompe LC più performanti, consentono di aumentare la velocità di analisi (UPLC o fast LC) e di effettuare procedure di screening più eterogenee mediante LC/MS/MS. Attualmente, esistono analisi che includono i diuretici tra le altre sostanze dopanti, in cui più di 100 composti diversi possono essere analizzati in meno di 10 minuti (Thorngren et al., 2008; Ventura et al., 2008).

Sintesi e conclusione:

I membri della classe dei farmaci diuretici variano notevolmente per struttura, proprietà fisico-chimiche, sito e meccanismo d’azione. Negli anni ’90 l’analisi dei diuretici nel doping (mediante LC-UV o GC/MS) rappresentava una sfida per i laboratori antidoping a causa dell’eterogeneità delle sostanze incluse. Dall’avvento di strumenti LC/MS consolidati e affidabili, la loro individuazione nei campioni di urina non è più un problema. Gli obiettivi futuri dell’analisi dei diuretici comprendono lo sviluppo di metodi di rilevamento più efficienti ed economici. Aumentare la sensibilità dei metodi e il numero di composti nello screening, riducendo al contempo i tempi e i costi di analisi per i laboratori, sarebbe un miglioramento auspicabile. Inoltre, lo sviluppo di metodi che combinino il rilevamento dei diuretici con altre sostanze proibite migliorerà la capacità dei laboratori di monitorare gli abusi e il doping nello sport.

In conclusione, l’uso dei diuretici, se specificatamente inteso in ambito Bodybuilding, viste anche le tecniche di ratio Sodio/Sale:Acqua, e l’utilizzo di ACE II inibitori per finalità lipolitiche indirette, nonché un adeguato rapporto tra introito di Sodio e Potassio, risulta molto limitato in senso di vantaggi concreti per l’atleta. L’effetto di aumento dell’Aldosterone androgeno-dipendente è facilmente gestibile con altri interventi fermo restando che la presenza di un ACE II inibitore nella preparazione rappresenta di per se un limite sensibile alla manifestazione tangibile del problema.

Gabriel Bellizzi [CEO BioGenTech]

Riferimenti:

• Corpus principale per la stesura del presente articolo: The abuse of diuretics as performance-enhancing drugs and masking agents in sport doping: pharmacology, toxicology and analysis

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