Mese: Maggio 2023

Introduzione:

Un parametro ematico spesso richiesto dagli utilizzatori di AAS è, non a caso, sia prima, durante e dopo il protocollo, il Testosterone. Tuttavia, sembra che ci siano molti equivoci su come interpretare questi valori. Le persone spesso interpretano questi valori come molto precisi. Ma non è così. I risultati delle misurazioni del sangue possono variare notevolmente, senza che i valori medi di Testosterone allo stato stazionario fluttuino nel tempo. In parte questo è il risultato della variazione del dosaggio: le tecniche utilizzate per misurare il Testosterone possono, e spesso lo fanno, dare valori diversi anche se si analizza lo stesso campione due volte. Semplicemente non sono perfette, soprattutto non lo sono i test immunologici o immunodosaggi comunemente utilizzati, che possono essere influenzati anche dalla presenza di altri AAS somministrati per via esogena. In questo articolo spiegherò come funzionano i test immunologici, in modo da poterne apprezzare meglio i risultati. Inoltre, i livelli di Testosterone sono semplicemente fluttuanti. In questo articolo mostrerò come esista una notevole variazione biologica che si traduce in differenze tra due misurazioni di Testosterone effettuate a distanza di giorni o mesi.

Misurazione dei livelli sierici di Testosterone: immunodosaggio.

L’immunodosaggio è un metodo economico e che può essere automatizzato, il che rende interessante per i laboratori commerciali offrire questa opzione. Di solito, questo è il modo in cui il Testosterone viene misurato se ci si sottopone al test (a meno che non si opti esplicitamente per l’altra opzione che tratterò più avanti).

Un immunodosaggio può essere condotto in vari modi, ma i principi fondamentali sono in gran parte gli stessi e quelli che misurano gli ormoni steroidei si basano sul legame competitivo con gli anticorpi. Semplificherò alcune cose, ovviamente, per motivi di brevità.

Quindi vi viene prelevato il sangue e ora volete sapere quanto Testosterone contiene. Più precisamente, si vuole conoscere la concentrazione di Testosterone nel sangue. Pertanto, un immunodosaggio deve captare in qualche modo il Testosterone, ignorando tutto il resto del contenuto ematico. L’immunodosaggio lo fa per mezzo di anticorpi. Gli anticorpi sono molecole che si legano in modo molto specifico a una determinata molecola. In questo modo catturano la molecola di interesse, ignorando tutto il resto (ci sono però alcune avvertenze).

Come funziona? In sostanza, si aggiunge il campione a uno speciale superficie plastica ricoperto di anticorpi. Questa superficie di plastica ricoperta di anticorpi viene anche chiamata fase solida. Come detto, questi anticorpi che ricoprono la superficie di plastica sono molto selettivi nel legare e non legare le molecole da campionare. L’anticorpo ideale per un immunodosaggio lega una e una sola molecola. Nel caso di un immunodosaggio del Testosterone, lega quest’ultimo e nient’altro. In questo modo può legare il Testosterone dal campione di sangue, ignorando tutto il resto.

Ma il “legame” è una cosa, quindi come si passa alla misurazione? Come si ottiene un valore di concentrazione? A tal fine, è necessario generare un segnale. Un segnale che possa essere misurato. Per questo motivo, i cosiddetti test immunologici competitivi prevedono l’aggiunta al campione di una quantità nota di un tracciante marcante. Questo tracciante è l’elemento che emette un segnale che può essere misurato. Una proprietà chiave di questo tracciante marcante è che si lega agli anticorpi – gli stessi a cui si legherà il Testosterone – in modo indirettamente proporzionale alla concentrazione di Testosterone nel campione! È qui che nasce la competizione. Da un lato c’è il Testosterone del campione che si lega a una quantità limitata(!) di anticorpi, dall’altro c’è il tracciante marcante che fa la stessa cosa. Entrambi vogliono legare gli stessi anticorpi: sono in competizione. Maggiore è la concentrazione di Testosterone, maggiore sarà la quantità di Testosterone che si legherà alla quantità limitata di anticorpi e quindi minore sarà la quantità di tracciante marcante che vi si potrà legare. E viceversa.

Una volta atteso un po’, affinché tutti i legami abbiano avuto luogo, si “lava via” la fase solida, in modo che rimangano solo gli anticorpi e ciò che è legato ad essi: il Testosterone e il tracciante marcante.

Con ciò che resta, si può misurare il segnale emesso dal tracciante marcante. Maggiore è la quantità di tracciante marcante, maggiore è il segnale e quindi minore deve essere la concentrazione di Testosterone. Dopo tutto, la quantità di anticorpi a cui legarsi è limitata. Quindi, se c’è molto Testosterone, questo competerà con il tracciante marcante per legarsi agli stessi anticorpi. Di seguito la rappresentazione dello schema:

Gli elementi arancioni sono gli anticorpi attaccati alla superficie di plastica (linea verticale nera), ovvero la fase solida. Il campione contiene Testosterone (in rosso) a cui viene aggiunto Testosterone marcato (in verde) in quantità nota. Dopo che si sono legati agli anticorpi, si lava via il materiale non legato e si misura il segnale rimanente, cioè la quantità di Testosterone marcato legato agli anticorpi del Testosterone. Più basso è il segnale, più alta è la concentrazione di Testosterone. È possibile ricavare la concentrazione di Testosterone osservando una curva di calibrazione dell’intensità del segnale e della concentrazione di testosterone realizzata con concentrazioni note dell’ormone.

Poiché la quantità di anticorpi è limitata, la concentrazione di Testosterone non può essere quantificata con precisione quando si iniettano grandi quantità di Testosterone. Oltre una certa concentrazione di Testosterone, (quasi) tutti gli anticorpi saranno comunque legati dall’ormone. Questo è quindi il limite superiore della concentrazione di Testosterone che l’immunodosaggio può misurare (in genere circa 60 nmol/L nella pratica). Questo problema può essere aggirato, in una certa misura, diluendo il campione, in modo da diminuire la concentrazione, ma questo deve essere richiesto specificamente.

Un altro problema dei test immunologici è che gli anticorpi, purtroppo, non sono assolutamente perfetti. In genere si legano anche ad altre molecole, che hanno una struttura simile, in una certa misura o in un’altra. In condizioni fisiologiche, queste altre molecole di solito non sono presenti in una concentrazione abbastanza elevata da influenzare significativamente i risultati del test. Tuttavia, le cose sono diverse quando si inietta nel corpo un cocktail di vari steroidi anabolizzanti, steroidi con struttura chimica simile che saranno presenti anche nel sangue in concentrazioni elevate. Questi possono legarsi e quindi influenzare la misurazione, fenomeno noto come reattività incrociata. Ad esempio, è stato riscontrato che il Methyltestosterone, il Boldenone e il Nandrolone reagiscono in modo incrociato in un immunodosaggio per il Testosterone di Roche [1]. Ciò significa che questi AAS, proprio come il Testosterone, diminuiscono il segnale e quindi portano a rilevare livelli di Testosterone elevati, falsamente misurati. Naturalmente, per ogni singola molecola, esse non influiscono sul segnale nella stessa misura in cui lo fa il Testosterone. Di solito si tratta solo di qualche percentuale di Testosterone. Ma qualche percentuale diventa considerevole se si iniettano dosi elevate. Inoltre, la reattività incrociata è in gran parte sconosciuta per molti steroidi anabolizzanti per vari test: potrebbe non essere troppo sorprendente se un certo steroide anabolizzante dimostra una considerevole reattività incrociata che è di decine di punti percentuale piuttosto che di qualche punto percentuale.

I test immunologici sono spesso imprecisi e inaccurati:

Nel 2007 sono stati pubblicati i risultati del programma di controllo della qualità del College of American Pathologists (CAP) [2]. In questo caso, sono stati inviati campioni in cieco a oltre 1000 laboratori. (Non si trattava di campioni di sangue veri e propri, e sospetto che i risultati sarebbero stati un po’ meno precisi e accurati se lo fossero stati). Hanno inviato tre diversi campioni a questi laboratori. Un campione con la concentrazione di Testosterone prevista per una donna normale, un altro per un uomo ipogonadico e uno per un uomo normale. Gli oltre 1000 laboratori hanno ottenuto valori medi di 33, 97 e 465 ng/dL per ciascuno di questi campioni. Fin qui tutto bene, sembra giusto. Tuttavia, c’era una marcata variabilità in queste misurazioni e mi concentrerò sugli ultimi due campioni.

Il valore più basso misurato nel campione ipogonadico era di 45 ng/dL, mentre il più alto era di 365 ng/dL. Si tratta di una differenza di 8 volte! Ora, naturalmente, questo non dice molto. Se si fa analizzare qualcosa da un miliardo di laboratori, si finirà invariabilmente per avere un paio di valori anomali (estremi). È meglio guardare alla deviazione standard, che era di 31ng/dL. In termini pratici, ciò significa che in circa 1 test su 4 si ottiene un valore inferiore a 66ng/dL o superiore a 128ng/dL. Anche questo non sembra molto, ma in termini percentuali si tratta semplicemente di una grande differenza. Fortunatamente questo non ha molta importanza nella pratica clinica, poiché in entrambi i casi si è chiaramente ipogonadici.

Ma che dire dell’altro campione che dovrebbe essere rappresentativo di un uomo normale? Quello con un valore medio misurato di 465ng/dL. Qui le cose si complicano un po’. Il valore più basso misurato era di 276ng/dL, che, a seconda dei sintomi, può essere considerato nell’intervallo ipogonadico. Il valore più alto è stato di 744ng/dL. La deviazione standard era di 81ng/dL. Ciò implica che circa 1 test su 4 avrebbe avuto un valore inferiore a 384ng/dL o superiore a 546ng/dL.

Queste differenze sono il risultato di una serie di ragioni. Una di queste è che i test immunologici non sono perfetti. È possibile analizzare lo stesso identico campione sullo stesso dispositivo e ottenere risultati diversi. Un’altra ragione è che un laboratorio potrebbe aver calibrato il proprio dispositivo in modo diverso dall’altro, portando così a risultati diversi con lo stesso campione, lo stesso dispositivo, ma tra laboratori diversi. Un altro motivo è che i dispositivi utilizzati per misurare il Testosterone variano da un laboratorio all’altro. Uno utilizza il Bayer X, un altro il Roche Y, un altro ancora il DPC Z, ecc. Questo aspetto va sempre tenuto presente quando si interpretano i valori di Testosterone ottenuti con gli immunodosaggi. Se oggi misurate 400ng/dL (13,9nmol/L) e un mese dopo 500ng/dL (17,4nmol/L), non significa certo che il vostro Testosterone sia aumentato. Potrebbe essere così! Ma potrebbe anche essere il risultato della variabilità del dosaggio: imprecisione o errore di misurazione. (O, naturalmente, un po’ di entrambi).

Per chi fosse interessato, ecco i risultati dei due campioni riportati nell’articolo:

Le misurazioni del Testosterone variano anche a causa delle variazioni biologiche:

I livelli di Testosterone non sono statici. Variano nel tempo. In un certo senso, oscillano intorno a un certo valore. Uno studio ha analizzato la variazione biologica e del dosaggio di vari ormoni, tra cui il Testosterone, e ha rilevato che la variazione biologica è maggiore di quella del dosaggio [3]. Per essere chiari: in questo studio è stato utilizzato un immunodosaggio per determinare i livelli di Testosterone. I soggetti sono stati esclusi dallo studio se facevano uso di farmaci che alterano i livelli ormonali. Inoltre, si sono assicurati che il campionamento venisse effettuato entro 4 ore dal risveglio del soggetto e che venisse posticipato a un altro giorno se l’ora del risveglio era sostanzialmente diversa dal normale schema del soggetto. Poiché i livelli di Testosterone seguono un andamento diurno, cioè i livelli più alti intorno al risveglio e una diminuzione verso la fine della giornata, le variazioni biologiche saranno un fattore ancora più importante se non se ne tiene conto.

L’insieme di queste variazioni può portare a risultati molto diversi tra una misurazione e l’altra. La differenza percentuale che verrebbe superata la metà delle volte(!) tra due misurazioni di Testosterone è di circa il 25%. Quindi, se oggi si misura 575ng/dL (20nmol/L), c’è il 50% di possibilità che la misurazione successiva sia inferiore a 460ng/dL (16 nmol/L) o superiore a 720ng/dL (25 nmol/L) a causa della variazione del dosaggio e della variazione biologica. Si verificheranno anche differenze notevolmente maggiori, ma meno frequentemente.

Queste variazioni di Testosterone saranno minori, ma comunque significativamente presenti, con misurazioni più precise come quelle effettuate con la cromatografia liquida tandem con spettrometria di massa (LC-MS/MS). Dopo tutto, più della metà delle variazioni sembra essere il risultato di variazioni biologiche. Tenetelo quindi sempre presente quando interpretate i valori ematici.

Conclusioni:

È difficile dire qualcosa sulle variazioni da piccole a moderate tra le misurazioni del Testosterone di un individuo. La variazione del dosaggio e la variazione biologica portano semplicemente a risultati diversi tra le misurazioni. Un calo tra una misurazione e l’altra non significa necessariamente che il Testosterone stia peggiorando, né che un aumento significhi necessariamente che stia migliorando. Occorre prendere in considerazione l’ampiezza della variazione e il valore medio su più test nel tempo, nonché i segni clinici di ipogonadismo quando si sospetta una carenza di Testosterone.

Gabriel Bellizzi [CEO BioGenTech]

Riferimenti:

• https://peterbond.org/

1. Krasowski, Matthew D., et al. “Cross-reactivity of steroid hormone immunoassays: clinical significance and two-dimensional molecular similarity prediction.” BMC clinical pathology 14.1 (2014): 1-13.
2. Cao, Zhimin Tim, et al. “Accuracy-based proficiency testing for testosterone measurements with immunoassays and liquid chromatography-mass spectrometry.” Clinica Chimica Acta 469 (2017): 31-36.
3. Brambilla, Donald J., et al. “Intraindividual variation in levels of serum testosterone and other reproductive and adrenal hormones in men.” Clinical endocrinology 67.6 (2007): 853-862.